소변 안정화 및 정규화 전략은 소변 EV 함량에 대한 편견 없는 분석을 선호합니다.

Scientific Reports 12권, 기사 번호: 17663(2022) 이 기사 인용

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소변은 비침습적 진단 지표의 이상적인 공급원입니다. 일부 본질적이고 방법론적인 문제는 여전히 액체 생검 기질로서의 잠재력을 최대한 발휘하는 데 장애가 됩니다. 혈액과 달리 소변 농도는 영양, 수분 공급 및 환경 요인에 따라 달라집니다. 소변은 요로 생식기의 EV로 풍부해지며, 보존, 정화 및 정규화는 개인 간 및 내부 비교에서 EV 하위 집합 분석에 편향을 도입할 수 있습니다. 본 연구에서는 적절하고 실행 가능한 소변 저장, 소량의 소변에서 단백질 및 RNA를 회수하기 위한 최적의 단일 단계 EV 정제 방법, 소변 EV RNA의 정량 분석을 위한 정규화 방법과 같은 편향을 줄이는 방법을 평가했습니다. 초원심분리, 화학적 침전 및 면역 친화성은 최대 6개월 동안 냉동 또는 실온에 보관된 건강한 기증자의 소변에서 EV를 분리하는 데 사용되었습니다. 입자 수 및 단백질 함량을 포함한 다양한 소변 생화학 및 EV 매개 변수를 소변 샘플 전체에서 비교했습니다. 이를 위해 나노입자 추적 분석(NTA)과 BCA, ELISA 및 WB 분석을 통한 단백질 평가가 수행되었습니다. 이러한 측정은 RT-PCR로 평가한 선택된 EV mRNA 및 miRNA의 상대적 존재비와 상관 관계가 있으며 세로 소변 샘플의 EV 함량 변화를 반영하고 수정하는 능력에 대해 순위가 매겨졌습니다. 모든 정제 방법을 사용하면 단 1ml의 소변에서도 EV를 회수하고 다운스트림 분석할 수 있습니다. 우리의 연구 결과는 RT에서 소변 저장 시 EV RNA의 장기 안정성뿐만 아니라 소변 내 EV 함량과 총 소변 단백질 및 알부민과 같은 일부 일상적으로 측정되는 생화학적 특징과의 탁월한 상관관계를 강조하지만 소변 정상화에 가장 일반적으로 사용되는 크레아티닌은 그렇지 않습니다. EV 분리주에서 mRNA와 miRNA를 비교 평가하면 특정 RNA, 특히 RNY4 및 소형 miRNA 패널이 나타났으며, 이 수준은 샘플 간 EV 변이를 잘 반영하므로 EV RNA 함량의 분석 후 정규화 도구로 유용합니다. 우리는 EV 바이오마커 연구의 편견 없는 판독을 위한 몇 가지 현실적인 소변 처리 및 정규화 솔루션과 소변 EV를 특정 조건 및 질병에 대한 바이오마커로 사용하는 대규모 검증 연구 설계를 위한 입력을 제공하는 일상적인 임상 샘플링 및 진단에 대해 설명합니다.

소변은 일련의 임상 상태, 특히 신장 질환이나 부상, 비뇨생식기암과 같은 비뇨생식기에 영향을 미치는 질환에 대한 잠재적으로 가치 있는 진단 지표의 매력적이고 다루기 쉬운 소스입니다. 또한, 비뇨기 바이오마커는 기타 암(예: 유방암 또는 폐암), 대사 및 내분비 장애(예: 당뇨병), 염증성 질환(예: 죽상동맥경화증 및 골관절염), 심지어 신경퇴행성 또는 신경정신과 같은 비뇨기과적 병리1,2에 대해서도 잠재력이 있는 것으로 나타났습니다. 질병. 질병을 진단하기 위해 소변 검사를 사용하는 것은 고대 관행(예: 당뇨병 환자의 포도당을 맛보거나 개미를 유인하여 검출하거나 "거품 검사"를 통해 신장 질환의 지표로 알부민을 검출)이며 기본 구성 요소로 남아 있습니다. 20세기와 21세기 초에 걸친 조사 의학의 발전3. 현대 오믹스 기술의 출현으로 수많은 소변 성분이 밝혀졌으며, 그 양적, 질적 변화는 임상 분야에서 진단 및 예측 가치를 가질 것으로 예상됩니다.

역설적이게도 소변은 진단 및 모니터링을 위해 종적으로 사용될 수 있는 액체 생검 바이오마커의 완전히 비침습적인 소스로서 여전히 과소연구되고 있습니다. 이러한 역설은 이 생체유체의 특정 특징과 바이오마커 후보의 검증 및 진단 분석 실행의 정량적 특권에 대한 통과를 여전히 방해하는 방법론적 장애물에 기인합니다.

80% abundance of small RNAs (miRNA) in all samples, but RNA content resulted too low to enable accurate Qubit 2.0 measurements, with some samples containing < 250 pg/μl. The latter was expected as our samples were obtained from urine volumes as low as 1 ml11. Therefore, we could not use a fixed RNA amount, but have decided to use an equal original urine volume for input normalization n amplification reactions. Such decision is in line with the common practice in diagnostic sampling22. MiRNAs are among the exosome cargo molecules that have elicited substantial interest and have been early approached for potential clinical interest. Different miRNAs have been described as associated to urinary vesicles in healthy or diseased subjects6,12,23,24,25. For the purpose of stability testing in this study we have first picked up several miRNAs commonly expressed in EVs, also in urine23,25. Within 1 month of storage, notoriously abundant miRNAs such as miR-21, 16 and 210 are successfully amplified (with Ct values ranging between 23 and 33) from exosome-sized vesicles purified from 1 ml of urine and showed high stability in samples preserved at RT (Fig. 3). The content of analyzed miRNAs was quantified as relative expression to that of a reference sample with known and constant RNA input (EV RNA from LnCAP cell culture)13,14. As expected, miR-451 resulted low abundant but was still revealed in all the samples tested. Increased stability of EV RNAs upon storage at RT was confirmed also after 6 months, in particular in UC samples. All three employed methods gave the material that can be reliably amplified and quantified, with the lowest miRNA expression obtained from IP samples. This result has been anticipated by an acknowledged fact that immunoaffinity selects for EV subpopulations, trading off the yield for specificity and purity. Interesting exception is observed for miRNA 210 that resulted highly enriched in IP samples (Fig. 3)./p>

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소변 안정화 및 정규화 전략은 소변 EV 함량에 대한 편견 없는 분석을 선호합니다.